Mutaties in het filamine A gen

De X-gebonden recessieve vorm werd voor het eerst beschreven door Monteleone en Fagan in 1969 en door Newbury-Ecob in 1993.
Voor deze studie werd gebruik gemaakt van een klinisch en genetisch gekarakteriseerde grote familie (familie 1a) die is aangedaan met X-gebonden myxomateuze klepdystrofie (XMVD) (OMIM 314400).

Met behulp van linkage analyse werd het gen gemapt tot een 8-cM interval op chromosoom Xq28. Een groot familiaal en genealogisch nazicht leidde tot de verfijning van de locus op het XMVD gen en standaard positie klonen identificeerde een P637Q mutatie in het filamine A (FLNA) gen bij alle aangedane familieleden. Screening van extra, kleinere, niet verwante families met ernstige vormen van klepdystrofie lieten toe nog drie andere mutaties in dit gen te vinden. De huidige studie toont aan dat filamine A het eerste bekende gen is verantwoordelijk voor geïsoleerde niet syndromale klepaandoeningen.

Methode
Klinische evaluatie
De studie werd uitgevoerd volgens de Franse richtlijnen voor genetisch onderzoek met toestemming van het ethisch comité van het universitair ziekenhuis van Nantes.
De klinische evaluatie omvatte een anamnese en een klinisch onderzoek met nadruk op het cardiovasculaire systeem en enige bindweefselziekten. De fenotypering van familieleden was gebaseerd op echocardiografie en de gebruikte data zijn deze van het meest recente onderzoek, met uitzondering van de patiënten die klepchirurgie ondergingen. Transthoracale echocardiogrammen werden gemaakt volgens de criteria van de American Society of Echocardiography. Metingen van de mitralisklep werden gedaan op de parasternale, lange as met 2D beelden. De lengte van elk klepblad werd bepaald onmiddellijk voor sluiting van de klep. De dikte van het vrije uiteinde van de mitralisklepbladen werd gemeten binnen een geselecteerd diastolisch frame dat de mitralisklepbladen en chordae duidelijk uiteen hield. Men ging ervan uit dat mitralisklepprolaps aanwezig was, wanneer tweedimensionale opnames in het parasternale lange as aanzicht een protrusie toonde van de mitralisklepbladen in het linker atrium voorbij de lijn tussen de annulaire scharnierpunten en wanneer het coaptatiepunt van de klepbladen ter hoogte van of boven het annulaire vlak blijft tijdens systole. Mitralisklepregurgitatie werd geschat met de standaardmethodes waaronder de PISA (proximale isovelociteit oppervlakte gebied) analyse. Aortaklepregurgitatie werd beschouwd als aanwezig te zijn, wanneer een abnormale diastolische flow vanuit de aortaklep in de linker ventriculaire outflow tractus werd gevonden. Beelden van de tricuspidalisklep werden gemaakt in vierkameraanzicht en de pulmonalisklep werd geanalyseerd in het hoge linker parasternale korte as zicht.
Patiënten werden gedefinieerd als aangedaan, wanneer de dikte van het vrije uiteinde van een of beide mitraliskleppen meer was dan 4 mm, met of zonder mitralisklepprolaps en mitralisklepregurgitatie op het echocardiogram vanwege de inconsistentie bij aangedane individuen. Omdat aortaklepdystrofie moeilijk te bepalen is op transthoracale echocardiografie werd de regurgitatie gekwantificeerd. Patiënten werden tevens beschouwd als aangedaan in geval van milde tot ernstige aortaklepregurgitatie.

Genetische analyse
Voor moleculaire studies werd DNA geïsoleerd uit perifeer bloed (lymfocyten) en uit paraffinegebonden klepweefsel volgens de standaard methode.

Linkage analyse, fijnere mapping en haplotype constructie
Familie 1 was reeds gelinkt aan chromosoom Xq28. Om de kandidaatregio te verkleinen werden 8 microsatellietmarkers (DXS998, DXS8091, DXS8069, DXS8061, DXS15, DXS1073, F8 en DXS1108) van de kandidaat geselecteerd om te gebruiken bij linkage analyse in de uitgebreide familie. F8 is een dinucleotidemarker binnen factor VIII genintron 13. Er werd een tweepuntslinkage analyse gedaan met het FASTLINK programma. Voor de linkage berekeningen werd aangenomen dat er sprake was van een X-gebonden overerving met een ziekte allelfrequentie van 0,0001 en 2% fenokopieën. De penetrantie werd gezet op 100% voor de mannelijke familieleden en op 70% voor de vrouwelijke familieleden. Alle familieleden werden meegenomen in de analyse. Patiënten werden gedefinieerd als aangedaan wanneer de dikte van de mitralisklep meer was dan 4 mm en wanneer milde tot ernstige aortaklepregurgitatie aanwezig was. Personen met een mitralisklepdikte minder dan 2 mm zonder aortaklepregurgitatie werden gedefinieerd als niet aangedaan en personen met een klepdikte tussen de 2 en 4 mm werden beschouwd als ‘fenotype onbepaald’. Om meer recombinaties te vinden en de locus te verfijnen werden 11 microsatellietmarkers (DXS8103, DXS1684, BXS10052, DXS10053, DXS10054, Afm308yhl, DXS10051, DXS10049, Afm0l82xa5, GABRA3 en DXS10047) gegenotypeerd bij de recombinante individuen om de centromerische grens te bepalen. Twee intragene microsatellietmarkers, GAB3 en F8, werden gebruikt om de telomerische grens te bepalen.

Analyse van kandidaatgenen en mutatieanalyse van FLNA
Kandidaatgenen in het Xq28 interval werden gescreend op mutaties met behulp van sequentie analyse bij een aangedaan persoon van de familie 1a. Coderende exonen en short flanking intronsequenties werden geamplificeerd met PCR en overmatige primer werd van de geamplificeerde fragmenten verwijderd met exoSAP en gesequenteerd met een dye-terminator cycle-sequencing systeem. De coderende sequentie van FLNA (exonen 2 tot 48) werden geamplificeerd van genoom DNA met behulp van primers zoals hiervoor beschreven.
Varianten van FLNA geïdentificeerd met de sequentie analyse werden bevestigd met restrictie-enzymdigestie met HaeIII en Sau96I. De benodigde exonen werden geamplificeerd met PCR, gedigesteerd met restrictie-enzymen en in stukjes geknipt op een 8% acrylamide gel. In de twee gevallen bleek de variant een restrictieplaats minder te hebben. De V711D mutatie werd bevestigd door afgeleide gekliefde geamplificeerde polymorfe sequencing. Om de frequentie van imitaties na te gaan werd gebruik gemaakt van sequentieanalyse, restrictie-enzymdigestie of afgeleide gekliefde geamplificeerde polymorfe sequencing met DNA van familieleden en van 500 controle chromosomen van Europese, Afrikaanse, of Aziatische origine.

Modelbouw
Om de structurele consequenties van de geïdentificeerde mutaties te bestuderen werd een driedimensionaal model geconstrueerd van humaan filamine. Dit geautomatiseerde homologe model werd gemaakt met het programma INSIGHTII.

Resultaten
Klinische evaluatie
Familie 1a is en eerder vermelde blanke Franse familie die is aangedaan met XMVD en bestaat momenteel uit 91 levende leden. De testpersoon (patiënt V-13) onderging een aortaklepvervanging vanwege rustige regurgitatie op de leeftijd van 17 jaar. De afmetingen en morfologie waren normaal en klinisch onderzoek bracht geen bindweefsel- of gewrichtsabnormaliteiten aan het licht. Hartauscultatie gaf een aortisch regurgitatie geruis en echocardiografie toonde ernstige regurgitatie. Op MRI bleken de dimensies van de thoracale aorta normaal en niets duidde op aspecten van Marfan of Ehlers Danlos. Histologisch onderzoek van de klep toonde typische kenmerken van myxomateuze klepziekte met duidelijke verdikking van het vrije uiteinde van de klep.
De neef van de testpersoon (patiënt V-10) onderging een valvuloplastie voor ernstige regurgitatie te wijten aan mitralisklep dystrofie op de leeftijd van 20 jaar. Detectie van een milde hemofilie A bij deze twee patiënten en een familiestudie leidden tot de identificatie van een zeer grote familie van meer dan 300 individuen. Onder de 44 mannelijke familieleden hebben er 10 progressieve mitralisklepprolaps, die in vier gevallen is geassocieerd met middelmatige tot ernstige aortische regurgitatie en waarvan er 4 klepchirurgie ondergingen. Van de 47 vrouwelijke familieleden konden allen worden beschouwd als aangedaan met mitralisklep-of aortaklepabnormaliteiten, ofschoon allen asymptomatisch waren. Een kind (patiënt V -8), gediagnosticeerd op de leeftijd van 10 jaar, toonde ernstige aortische regurgitatie met aortaklep stenose. Bij alle aangedane familieleden was de klepziekte geassocieerd met een milde hemofilie A (Factor VIII activiteit tussen 15% en 50%).

Figuur 3. Familie 2	Familie 2 was een Britse familie met XMVD. De testpersoon (patiënt IV-1) was geboren met ernstige aangeboren klepziekte en overleed 24 uur na de geboorte aan ernstig hartfalen. Autopsie toonde dystrofie van alle vier de kleppen en een atriumseptumdefect. Zijn grootvader (patiënt II-2) onderging een mitralisklep vervanging en sluiting van een persisterend foramen ovale op de leeftijd van 41 jaar. Tijdens de chirurgie bleken de kleppen myxomateus en dystrofisch te zijn. Hij was gediagnosticeerd met mitralisklep- en aortaklepziekte op de leeftijd van 30 jaar. Het eerste kind van gezonde zwarte Afrikaanse ouders (familie 3) was een jongetje. Antenataal was hij gediagnosticeerd met abnormaal dikke hartkleppen op foetale echocardiografie en werd geboren op 38 weken in goede gezondheid. Postnatale echocardiografie bevestigde middelmatige tricuspied incompetentie, triviale mitralisklep en pulmonalisklep incompetentie, en milde aortaklep incompetentie. Alle kleppen waren verdikt en dystrofisch. Op de leeftijd van vier maanden was zijn groei en ontwikkeling normaal en toonde hij geen kenmerken van cardiaal falen. Een echocardiografie toonde een uitstekende ventriculaire functie. De mitralisklep bleef dystrofisch zonder bewijs van regurgitatie en er was een zeer milde aortaklepregurgitatie. Zijn moeder was klinisch onderzocht en toonde geen spoor van hartafwijking. Familie 4 was van Chinese origine. De twee jongens, 4 en 12 jaar oud, hadden beide mitralisklep en aortaklep dystrofie. Bij de patiënt II-1 werd en hartgeruis gevonden op de leeftijd van vier maanden tijdens een routineonderzoek. Aanvullende echocardiografie toonde aan dat hij een polyklepziekte had met myxomateuze verdikking van de mitralisklep, tricuspidalisklep en aortaklep. Hij had een significante mitralisklep- en tricuspidalisklepregurgitatie en milde aortaklepregurgitatie. Patiënt II-2 werd geïdentificeerd door het verhaal van zijn broer. Ook hij bleek de polyklepziekte te hebben. Al deze vier families hadden klinisch geen extracardiale abnormaliteiten, geen dysmorfe kenmerken en geen epilepsie.
Figuur 4. Familie 3	Figuur 5. Familie 4

Linkage analyse en mapping ter inperking van de locus
Een significante linkage (Zmax=8,6 bij θ=0 voor DXS1108) werd verkregen voor familie 1. Om de XMVD locus te verfijnen werden additionele markers gegenotypeerd. Recombinatie op DXS10049 voor de niet aangedane mannelijke patiënt IV-54 van familie 1a levert de centromerische grens van de locus. Analyse van markers van leden van familie 1b toont hetzelfde ziekte haplotype, met uitzondering van patiënt IV-3. Deze persoon die is aangedaan met klepdystrofie, maar met een normale coagulatiefactor activiteit had een recombinatie van microsatellietmarker GAB3, hetgeen de telomerische grens van de gelinkte regio aanduidt en aantoont dat de valvuloplastie en hemofilie onafhankelijk werden overgedragen. Het ziektegen bevindt zich dus ergens tussen DXS10049 en GAB3, een interval van 2,5 Mb, dat niet het factor VIII gen bevat.

Mutatie identificatie
Na uitsluiting van kandidaatgenen in het ziekte interval en verscheidene voorspelde genen, werd FLNA onderzocht door middel van directe sequencing. Het is opgebouwd uit 48 exonen, ongeveer 26 Kb, distaal grenzend aan het emerinegen. Mutatie analyse van alle coderende regionen van FLNA bij de aangedane leden van familie 1 toonde aan dat allen een C-aan-A transitie hebben van nucleotide 1910 in exon 13. Dit voorspelt een missense mutatie substitutie van proline (P) voor glutamine (Q) in aminozuur 637. Bij familie 1 zijn in totaal 13 aangedane mannelijke familieleden en 30 vrouwelijke familieleden mutatiedragers. Een klinisch aangedane vrouw (patiënt IV-4) erfde de mutatie niet en bleek een fenokopie te zijn. Een G-aan-A transitie van nucleotide 862 in exon 5, wat duidt op een missense mutatie van glycine (G) voor arginine (R), werd gevonden bij de aangedane leden van familie 2. Bij het aangedane lid van familie 3 was er een T-aan-A transitie van nucleotide 2132 in exon 14 wat leidt tot valine (V) voor aspartaamzuur (D) in aminozuur 711. De relaties in sequentie werden niet gevonden bij niet aangedane familieleden of bij de 500 controlechromosomen van zowel blanken als zwarte Afrikanen.
De mutaties werden bevestigd door te testen op verlies van een HaeIII (P637Q) en Sau96I (G288R) restrictieplaats respectievelijk de gederiveerde gekliefde en geamplificeerde polymorfe sequentie (V711D. Tot slot werd een 1944-bp genoomdeletie gevonden coderend voor exonen 16 tot 19, overeenkomend met de 546-bp coderende sequentie (NT_025965.13:g.942144_944086del1944insTG) die een in-frame deletie van 182 residuen voorspelt (van V761 tot Q943) bij twee jongens (familie 4) gediagnosticeerd met polyklepdystrofie. De deletie werd gevisualiseerd met PCR en sequencing reactie van intron 15 tot 19 om aan te tonen dat aangedane individuen een kleiner PCR product hebben, hetgeen overeenkomt met een deletie van 1944 bp. Deze deletie werd niet gevonden in 200 controlechromosomen, waaronder 100 Aziatische chromosomen.
Naast de mutaties geïdentificeerd in FLNA werden ook andere gekende polymorfismen gevonden bij de patiënten. Deze één-nucleotide polymorfismen traden op met relatief normale frequenties en sommigen ervan resulteerden in aminozuursubstitutie. Er werden geen andere ziekte geassocieerde varianten gevonden. Screening van drie andere families met potentieel X-gebonden valvulaire dystrofie toonde geen mutaties in FLNA.

Genotype-fenotyperelaties in familie 1

Relaties bij mannelijke familieleden
In familie 1 waren 13 mannen drager van de P637Q mutatie. Alle mannelijke dragers hadden mitralisklep problemen en twee van hen hadden reeds chirurgie ondergaan hiervoor op de leeftijd van 20 respectievelijk 51 jaar. Op een na hadden alle mannelijke dragers mitralisklepprolaps. Vier van hen hadden een prolaps van het anterieure klepblad, acht van hen van beide klepbladen. Geen van hen had een geïsoleerde prolaps van het posterieure klepblad. De diktes van de mitraliskleppen bedroegen 5,3±1,1 mm voor het anterieure klepblad en 4,4 ±0,9 mm voor het posterieure klepblad. Op een na hadden allen tevens aortaklepregurgitatie. In zes gevallen mild was deze, bij drie matig en bij drie ernstig, dus leidend tot aortaklepvervanging. Er waren geen afwijkingen aan de aortaboog en alle aortakleppen waren tricuspied. De leeftijden van aortaklepvervanging lagen tussen de 17 en 52 jaar. Bij 11 mannelijke dragers werd milde tot middelmatige tricuspidalisregurgitatie gevonden en milde pulmonalisregurgitatie bij vier dragers. Voor deze problemen was echter geen chirurgie noodzakelijk.

Relaties bij vrouwelijke familieleden
Geen van de 30 heterozygote vrouwen was symptomatisch en geen onderging klepchirurgie. Onder de vrouwelijke dragers van de P637Q mutatie werden er 14 als aangedaan beschouwd, 12 twijfelgevallen vanwege mineure klepziekte en 4 als niet aangedaan. In vier gevallen werd mitralisklepprolaps gevonden, waarvan bij drie gevallen het anterieure klepblad was aangedaan en bij een het posterieure. Onder de heterozygote vrouwen hadden er 10 een milde mitralisklepregurgitatie en 4 een middelmatige. De klepdiktes bedroegen 3,3±0,5 mm voor het anterieure klepblad en 2,8±0,7 mm voor het posterieure klepblad. De klepbladen waren dus bij de mannen significant dikker dan bij de vrouwen. Acht heterozygote vrouwen hadden een milde aortaklepregurgitatie, drie een middelmatige en een een ernstige. Negen heterozygote vrouwen hadden een milde tricuspidalisklepregurgitatie, een een middelmatige. Twee heterozygote vrouwen hadden een milde pulmonalisklepregurgitatie, een een middelmatige.

Structurele aspecten van de FLAN mutaties bij XMVD

Sequentievergelijkingen toonden aan dat alle drie de missense mutaties modificaties zijn van sterk geconserveerde residuen waarvan er minstens tien ver teruggaan in de evolutie en dientengevolge bij vele gewervelden voorkomen.De G288R, P637Q, en V711D mutaties zijn gelokaliseerd binnen de eerste, de vierde en de vijfde repeat en leiden tot een kleiner eiwit dat repeats 5 tot 7 mist.

Figuur 6. Schematische weergave van het bindend domein van een filaminemolecuul met aanduiding van gestoorde punten

Figuur 7. Model van humaan filamine. De antiparallelle β-ketens zijn geel en de gekleurde bollen stellen uitvergroot de al dan niet foutieve aminozuren voor.

Het voorspelde driedimensionale model van humaan filamine bestaat uit zeven antiparallelle strengen gelegen in twee vlakken. In het model is te zien dat het Gly288 residu gelegen is op het externe oppervlak, terwijl de Pro637 en Val711 residuen intern gelegen zijn. Voor alle mutanten geldt dat de vervanging van een apolair residu voor een polair residu (G288R basisch, P637Q ongeladen en V711D zuur) leidt tot een verhoogde polariteit en dus een significante verandering in de structurele confirmatie van de strengen teweeg brengt. Alle drie de substituties samen leiden tot verstoring van de proteïne-ligand-receptor binding.

Bespreking

In deze studie werd de identificatie van FLNA als het eerste verantwoordelijke gen voor een niet syndromale klepdystrofie besproken. De identificatie van dit genetische defect, overgedragen volgens een X-gebonden recessief patroon, werd ondersteund door een aanpak met genealogische en geografische oogpunten. Uit het onderzoek is bewijs voortgekomen dat aantoont dat de P637Q mutatie in het FLNA gen verantwoordelijk is voor het klepdefect in familie 1. Linkage analyse leverde positieve LOD-scores op en alle aangedane mannen zijn dragers van de mutatie. Daarnaast leverde screening van extra ongerelateerde families met klepdystrofie nog drie andere mutaties van het FLNA gen (G288R, V711D, en een 182 aminozuurdeletie). Geen van deze mutaties werd gevonden in de 500 controle chromosomen. Alle missense mutaties bevonden zich in de regio coderend voor filamine. Binnen de families met XMVD werd de ziekte overgeërfd met complete penetrantie bij mannen en incomplete penetrantie bij vrouwen met variabele gradaties in expressie consistent met verschillende X-chromosoom inactivatie patronen. Onder de 13 mannelijke dragers van de P637Q mutatie, hadden er 12 een typische mitralisklepprolaps gekarakteriseerd door verdikte klepbladen en geassocieerd met milde tot ernstige aortaklepregurgitatie en in 11 gevallen tricuspidalisklepregurgitatie. Onder de 30 vrouwen waren er 14 aangedaan (zoals te verwachten viel ongeveer de helft). De vrouwelijke dragers hadden wel dikkere kleppen dan de normale vrouwen, maar waren toch minder ernstig aangedaan dan de mannen (geen van hen onderging klepchirurgie).
De leeftijd voor klepchirurgie varieerde tussen de 17 en 52 jaar in familie 1. De diagnoseleeftijd was sterk variërend en lag binnen familie 1 tussen de 11 en 55 jaar. Bij familie 2 waren twee patiënten gediagnosticeerd met polyklepziekte op de leeftijden 25 en 30 jaar en eentje bij geboorte. Bij familie 3 werd polyklepziekte reeds antenataal gediagnosticeerd en op 4 en 12-jarige leeftijd bij familie 4.

Figuur 8 De TGF-β signaaltransductiepathway.

Filamine A is een fosfoproteïne dat actinefilamenten kruiselings verbindt en het actine cytoskelet aan het plasmamembraan bindt door interactie met actine en membraanproteïnes zoals β-integrines. Filamine bestaat uit een actinebindend domein aan de N-terminus en 24 homologe repeats die de ruggengraat van het proteïne vormen. Iedere repeat bestaat uit 7 antiparalelle β-ketens die in 2 β-vlakken gerangschikt zijn. Filamines bestaan in vivo als dimeren gemedieerd door interacties tussen de C-terminale sequenties.
Naast zijn rol als structuurcomponent van het cytoskelet heeft filamine A ook een rol in de regulatie van diverse signaaltransductiepathways in en rond de cellen. Het kan bijdragen aan de ontwikkeling van myxomateuze klep veranderingen door de regulering van TGF-β en aldus leiden tot volledig ontaarde reactie cascades zoals teruggevonden in ontwikkelingsmodellen. Bij muizen blijkt dat filamine interageert met de TGF-β en BMP signaalinhibitor Smad6. Gebrek aan Smad6 bleek te leiden tot hyperplasie van de hartkleppen. BMP6-BMP7 dubbelmutanten blijken echter weer hypoplastische kleppen te hebben.
De verzwakte kleppen kunnen vervormd raken door hemodynamische stress, hetgeen bepalend is voor de leeftijd waarop de klachten tot uiting komen. De hogere drukken die optreden in de linker caviteiten kunnen verklaren waarom zowel de aortaklep als de mitralisklep dikwijls zijn aangedaan. Pulsflow heeft een welbekend effect op celmorfologie en samenstelling van de extracellulaire matrix. Bindweefselcellen in mechanisch actief milieu overleven toegepaste fysische krachten door modificatie van een actine cytoskelet dat de celmembraan beter stabiliseert. Een andere verklaring is dat modificatiegenen de progressiegraad van de ziekte kunnen beïnvloeden.
Vervorming van mitraliskleppen kan veroorzaakt worden door defecten in proteïnes van de extracellulaire matrix gelijkaardig aan de cytoskelet eiwitten en signaaltransductiepathways die transmissie mediëren tussen de extracellulaire matrixproteïnes en het cytoskelet bij syndromale klepdystrofie. Identificatie van nieuwe genen die mitralisklepprolaps veroorzaken laten toe deze hypothese te bevestigen.
Afzonderlijke mutaties van de filaminegenen produceren verschillende fenotypes. Mutaties in de FLNB and FLNC genen werden gevonden bij skeletale en musculaire stoornissen. Mutaties in het FLNA gen werden eerder toegeschreven aan humane periventriculaire nodulaire heterotopie, otopalatodigitale syndromen, frontometafyseale dysplasie en Melnick-Needles syndroom. Klepziekte werd vermeld bij frontometafyseale dysplasie en periventriculaire nodulaire heterotopie met Ehlers-Danlos. Al deze voorgenoemde aandoeningen werden in de families van deze studie niet gevonden. Omdat er geen extracardiale aandoeningen werden gevonden, kan gesteld worden dat het in dit onderzoek gaat om een geïsoleerde vorm en niet om een onderdeel van een syndroom.
De mechanismes waardoor verschillende mutaties van FLNA leiden tot een variabele expressie van de ziekte blijven vooralsnog onbekend. Een groot aantal mutaties bij periventriculaire heterotopie zijn nonsense en splicing mutaties en alle mutaties die zijn geïdentificeerd bij de andere aandoeningen zijn missense mutaties die zich clusteren in kleine regio’s van het proteïne zonder een duidelijk genotype-fenotype correlatie. De verschillende fenotypes kunnen duiden op verschillende interacties van filamine met een bepaalde bindingspartner.