Een genlocus op chromosoom 13 en hoe men ertoe kwam 

Inleiding

Hoewel autosomaal dominante overerving beschreven is van mitralisklepprolaps en mitralisklepprolaps optreedt bij bindweefselstoornissen zoals de ziekte van Marfan, hebben voorgaande studies gefaald in het vinden van linkage van familiale mitralisklepprolaps met fibrillaire collageengenen. Deze negatieve linkage resultaten kunnen te wijten zijn aan gebrek aan systematisch onderzoek van het gehele genoom en de onzekerheid van de fenotypische diagnose. Recentelijk is er, naast de vanzelfsprekende verbetering in laboratoriumtechnieken,  een sterke verbetering geweest van het inzicht in de vorm van de mitralisklep, de specificiteit van  de echocardiografische diagnostiek, waardoor een kwalitatief beter vertrekpunt ontstond voor genetische studies.

De studies naar genloci op chromosomen 11, 16 en geslachtschromosoom X lieten reeds de kracht van de fenotypering zien en bevestigen  de genetische heterogeniciteit van deze veelvoorkomende aandoening.De bevindingen uit deze studies suggereren de hypothese dat mitralisklepprolaps een gezamenlijke uitkomst kan zijn van een of meerdere genetische defecten vergelijkbaar met familiale hypertrofische cardiomyopathie. Het vinden van extra loci die verschillende maar wel functioneel gerelateerde genen bevatten kan behulpzame aanwijzingen geven voor de genidentificatie en verbetering van het inzicht in de pathogenese, met als uiteindelijk doel de ontwikkeling van doelgerichte therapieën. Het bestuderen van familiale mitralisklepprolaps kan tevens meer inzicht geven in de klinische bevindingen van momenteel onbekende significantie door te gaan testen op linkage bij individuen met variaties in mitralisklepmorfologie die niet voldoen aan de standaardcriteria. In het nu volgende stuk wordt beschreven hoe men tot de vondst van een locus op chromosoom 13 is gekomen.

Methodiek

Stamboomcollectie

Deze studie werd gedaan op een stamboom met 46 individuen verdeeld over drie generaties. Echocardiografie en bloedstalen werden verkregen van 43 leden. De familie werd geselecteerd vanwege zijn grootte, het aantal leden met volledig gediagnosticeerde mitralisklepprolaps en de afwezigheid van de tekenen van Marfan.

Klinische evaluatie

Er werd een gedetailleerde anamnese gedaan bij elk familielid met speciale aandacht voor de volgende zaken:
(1) een bewijs voor de syndroom van Marfan of andere bindweefselstoornissen;
(2) een geschiedenis van paniek aanvallen met anticipatieangst of een soortgelijke;
(3) thoraxdeformaties;
(4) symptomen van pijn op de borst, kortademigheid en palpitaties;
(5) progressie van mitralisklepregurgitatie, chordale ruptuur en chirurgische klepreparatie; (6) geschiedenis van plotse dood met of zonder reanimatie;  
(7) geschiedenis van congenitale hartziekte, cardiomyopathie of coronair lijden.
Meer specifiek werd het syndroom van Marfan bevraagd met behulp van items als de aanwezigheid van gewrichtlaxiteit, een grote lichaamslengte met relatief lange ledematen, aortadissectie en aneurysmata, scoliose en oculaire afwijkingen. Deze aandoening werden tevens uitgesloten met behulp van oppuntstelling van lichamelijke kenmerken en echocardiografische evaluatie van de aorta.

Verzameling van gegevens

Bloedstalen werden verzameld van 43 van de 46 familieleden op het moment van echocardiografie. Getransformeerde lymfoblastcellijnen werden verkregen bij hen met bevestigde mitralisklepprolaps. Er werden complete driedimensionale en Doppler-echocardiogrammen gemaakt met een 2,5 tot 5,0 MHz transducer voor optimale resolutie. Mitralisklepprolaps werd gediagnosticeerd in de lange as aanzichten die de hoogste annulaire punten bevatten. De mediale, centrale en laterale schelpen werden systematisch gescand om de maximale systolische klepbladverplaatsing ten opzichte van de annulus te meten. Personen met zowel verdikte (groter dan 5 mm) als relatief dunne klepbladen werden geacht volledig diagnostische mitralisklepprolaps te hebben, omdat beide optraden binnen dezelfde stamboom. Omdat het laterale klepblad moeilijk te evalueren is op het lange as aanzicht, werd verplaatsing hiervan gemeten in het apicale vierkameraanzicht, maar altijd bevestigd in de lange as scans. De dikte van het middendeel van het klepblad werd onderzocht tijdens diastase van de klepbladen om focale verdikking uit te sluiten.

Echocardiografische classificatie

Echocardiografische classificatie werd gedaan voor de genetische analyse. Op basis van eerdere klinische en prognostische studies wordt klassieke mitralisklepprolaps gediagnosticeerd wanneer de klepbladverplaatsing de 2 mm overschrijdt en de maximale dikte groter is dan 5 mm. Mitralisklepprolaps wordt beschouwd als niet-klassiek wanneer de klepbladverplaatsing de 2 mm overschrijdt maar de maximale dikte kleiner is dan 5 mm. Tijdens de genetische studie werd gekeken naar zowel de klassieke als de niet-klassieke vorm. De varianten met een onzekere klinische significantie werden beschreven aan de hand van het veelvoorkomende kenmerk van posterieure klepbladasymmetrie, hetgeen frequent voorkomt bij hen met een duidelijke diagnose.

Zes individuen met borderline gradaties van verplaatsing (minder dan 2 mm verplaatsing van het posterieure klepblad en niet geassocieerd met toegenomen klepbladverdikking, mitralisklepregurgitatie, vergroting van het linker atrium of klepgerelateerde complicaties) werden geclassificeerd in de groep "minimale systolische verplaatsing" en deze zes individuen werden beschouwd als "diagnostisch onduidelijk" in plaats van als "niet aangedaan" bij de genetische analyse. Deze methode liet toe dat in sommige gevallen een minimale verplaatsing kon worden gezien als een vorm van milde expressie en niet een fysiologische variant van de klepbladpositie.

Ook werd een interessante prodromale morfologie herkend. Bij deze personen is er conform de criteria geen duidelijke klepbladverplaatsing ten opzichte van de annulus, maar een patroon van klepbladsluiting of coaptatie overeenkomstig met dat van hen die wel aan de criteria voldoen. Normaal gesproken treffen de klepbladen elkaar posterieur binnen de linker ventriculaire caviteit omdat het posterieure klepblad korter is dan het anterieure. Bij patiënten met mitralisklepprolaps is de coaptatie typisch naar anterieur verplaatst, hetgeen consistent is met de elongatie van het posterieure klepblad en wat een excessieve klepbladbeweging kan veroorzaken, niet alleen binnen het linker atrium maar ook richting de aorta. Deze verplaatsing blijkt kwantitatief gecorreleerd te zijn met de posterieure klepbladlengte. Daardoor wordt de suggestie gewekt dat het hierbij gaat om een prodromale manifestatie van familiale mitralisklepprolaps, zonder de diagnostische klepbladverplaatsingscriteria, maar wel met twee andere kenmerken: anterieure verplaatsing van het coaptatiepunt meer dan 40% langs de annulus en een klepblad coaptatiepatroon gelijkaardig aan dat gezien bij familieleden met volledige expressie. Dit patroon van relatief uitpuilen van het posterieure klepblad naar anterieur, dat gezien wordt bij alle patiënten met posterieure klepbladprolaps en bij velen met een prolaps van de twee klepbladen, werd gezien bij twee leden van deze stamboom. Vanwege de gelijkaardigheid met volledig gediagnostiseerde mitralisklepprolaps, werden deze personen gecodeerd als “aangedaan” binnen de studie.

Genoomscan en linkage analyse

Voor het starten met het scannen van het hele genoom, de genoomscan, werd met het SLINK programma geverifieerd dat de stamboom geschikt was voor de detectie van linkage. Om te bepalen in hoeverre de familie iets te maken had met de reeds bekende MMVP1 en MMVP2 loci, werd een subset van de familie gegenotypeerd voor de volgende markers: MMVP1, D16S404-D16S3103-D16S420-D16S3133-D16S3068-D16S3080-D16S515; en MMVP2, D11S4046-D11S4124-D11S2349-D11S1338-D11S1331-D11S932-D11S4465-D11S1349-D11S902-D11S1359-D11S904-D11S914-D11S935-D11S905.
Omdat geen bewijs voor linkage werd gevonden, werd de genoomscan uitgevoerd op 14 familieleden, waarbij een panel van 382 genetische markers werd gebruikt, die het volledige humane genoom dekken tot op 10cM intervallen nauwkeurig. Het betreft hier het MGH Genomics Core Facility linkage panel, waarvan het grootste deel afkomstig is van de ABI Prism Linkage Mapping Set versie 2.5. De gemiddelde heterozygositeit van deze markers is 0,79. Specifieke allelfrequenties zijn beschikbaar op www.appliedbiosystems.com. Wanneer een betere mapresolutie nodig was, werden markers toegevoegd uit de Cooperative Human Linkage Center Weber Human Screening Set versie 8. Indien beschikbaar werden de markerafstanden verkregen uit de Marshfield sekse gemiddelde genetische kaart (http://research.marshfieldclinic.org). De fysieke locatie werd gebruikt om korte genetische afstanden te bepalen, indien in de beschikbare linkage map geen markers beschikbaar waren. Behalve bij de X-gebonden vorm, bleek familiale mitralisklepprolaps in de meeste gevallen te segregeren als een autosomaal dominante aandoening met verminderde penetrantie.
Omdat het ware genetische model van mitralisklepprolaps onbekend was ten tijde van de studie werd initieel een niet parametrische linkage (NPL) analyse gedaan met behulp van het GENEHUNTER programma. Dit type van analyse onderzoekt allelen die aangedane individuen gemeenschappelijk hebben en behoeft geen specificatie van het genetisch model. Daarom kan deze NPL analyse fenotype-allel associaties tonen, die gemist kunnen worden bij een parametrische analyse van een incorrect model. Het GENEHUNTER programma beperkt de stamboom met een specifieke formule, namelijk 2n - f ≤ 20 (met n is 'nonfounders' en f is 'founders'). GENEHUNTER kapt stambomen die deze afmeting overschrijden af. Na analyse van de genoomscandata werden alle individuen gegenotypeerd voor markers op chromosoom 13. Om de genetische analyse op de gehele familie uit te voeren werden tevens tweepunts LOD-scores berekend tussen de ziekte en de individuele markers, waarbij gebruik werd gemaakt van het MLINK programma van FASTLINK 3.0. Daarbij werden multipunts LOD-scores voor de hele familie berekend met LINKMAP. Omdat mitralisklepprolaps geassocieerd is met zowel geslachtafhankelijke als leeftijdsafhankelijke penetrantie werd de analyse uitgevoerd op basis van het eerder beschreven model. Het betreft hier een autosomaal dominante overerving met onvolledige penetrantie en een ziektegenfrequentie van 0,005, met een fenokopieratio van 1% als bijdrage voor de hoge incidentie van sporadische mitralisklepprolaps. Penetrantie voor een leeftijd boven de 15 jaar zat op de 95% voor de vrouwen en 63% voor de mannen. Voor een leeftijd onder de 15 jaar was dit respectievelijk 32% en 21%. Om te bewijzen dat de linkage bevindingen "waterdicht" waren voor het aangenomen genetische model, werd ook een strenger model gebruikt waarin alle niet aangedane personen jonger dan 40 jaar uitgesloten werden en een complete penetrantie van de ziekte zonder fenokopieën werd aangenomen. Om de beperkingen van GENEHUNTER met betrekking tot familiegrootte te overkomen en bij het beperkte aantal markers gebruikt in LINKMAP, werd een SIMWALK analyse uitgevoerd, die evaluatie van de gehele stamboom met gebruik van alle 31 markers op chromosoom 13 toeliet. Haplotypes in de gelinkte regio werden manueel geconstrueerd en bevestigd met zowel GENEHUNTER als SIMWALK.

Fysieke en transcriptie kaarten

Op basis van data van de UCSC Human Genome Browser in mei 2004 werden een fysieke kaart en een transcriptie kaart voor de MMVP3 locus geconstrueerd.

Resultaten

Figuur 1. De stamboom die werd gebruikt door de onderzoeksgroep van Nesta

In de afbeelding is de complete stamboom te zien. De beide stamoudsten zijn van West- Europese afkomst. Bloed en echocardiografie werden verkregen van 43 van de 46 personen (19 mannelijke en 24 vrouwelijke personen in de leeftijd tussen 7 en 75 jaar). De twee stamoudsten werden geëlimineerd en persoon 203 deed niet mee. De echocardiografische karakteristieken van de negen patiënten die volledig aan de klinisch diagnostische criteria voor mitralisklepprolaps voldoen worden in de tabel vermeld.

Figuur 2. De echocardiografische karakteristieken van de patiënten die aan de diagnostische criteria voldoen. Uit het artikel van Nesta.

Twee van deze negen personen hadden gemiddelde tot ernstige mitralisklepregurgitatie, een had geruptureerde chordae tendineae die chirurgische interventie behoefte. Geen van de onderzochte personen had endocarditis of plotse dood in de voorgeschiedenis. In de hele stamboom waren geen extracardiale manifestaties van bindweefselabnormaliteiten of ziekte van Marfan aanwezig. Vier personen, twee met mitralisklepprolaps en twee zonder, hadden paniekaanvallen in hun voorgeschiedenis. Drie leden met mitralisklepprolaps volgens de diagnostische criteria hadden een combinatie van pijn op de borst, kortademigheid en palpitaties. Van hen had slechts één voorkamerfibrillatie op elektrocardiogram. Geen van de individuen had thoracale deformaties. Een van de niet aangedane individuen had een bicuspide aortaklep en geen van de familieleden was bekend met cardiomyopathie of coronair lijden.

Morfologische heterogeniteit

Het bekijken en vergelijken van echobeelden van verschillende familieleden leverde een scala aan fenotypische morfologieën op. Van de 43 individuen uit de stamboom hadden er volgens de criteria negen mitralisklepprolaps met een variërende betrokkenheid van het klepblad, waarvan vijf van de negen een asymmetrische prolaps van het posterieure klepblad. Dit is een veelvoorkomend patroon voor mitralisklepprolaps. Klepbladverdikking en graad van mitralisklepregurgitatie varieerden. Zes gerelateerde individuen hadden vormen die niet voldeden aan de huidige diagnostische criteria: twee met de prodromale morfologie en vier met minimale verplaatsing. Daar komt bij dat de twee broers/zussen in de tweede generatie ook een minimale verplaatsing hadden. Al deze individuen hadden een asymmetrische coaptatie gemeen, evenals de meesten die voldeden aan de volledige diagnostische criteria. Deze asymmetrie werd dikwijls opgemerkt door een excentrische naar anterieur gerichte regurgitatiestroom. Bij de prodromalen was de coaptatie naar anterieur verplaatst naar een punt 50% boven de annulaire diameter (normaal 25%).

Genoomscan en linkage analyse

SLINK analyse voorspelde dat de stamboom een ‘sterkte’ van ongeveer 50% had voor de detectie van een LOD-score van 2,0, hetgeen bewijs zou suggereren van linkage. De maximale voorspelde LOD-score verkregen uit een sample van 500 replicanten was 4,62 en de gemiddelde LOD-score was 2,09. Daarom werd een genoomscan uitgevoerd voor 14 individuen, inclusief 9 individuen met volledige diagnostische mitralisklepprolaps, de 2 prodromalen, 1 individu met minimale systolische verplaatsing en 2 niet aangedane individuen (de ouders van generatie 3). De GENEHUNTER resultaten van de initiële genoomscan toonden vier regio's met NPL scores boven de 2,0 en P<0,05 op chromosomen 4, 11 (58 cM van MMVP2 gelegen), 13 en 18. De hoogste scores werden verkregen voor chromosoom 13 met D13S170 (NPL= 3,04; P<0,01) en D13S265 (NPL=6,62; P<0,004). Ervan uitgaande dat het beste bewijs voor linkage op chromosoom 13 te vinden was, werden de genetische marker maps  doorzocht en de gehele familie gegenotypeerd met de markers die D13S265 omgeven. GENEHUNTER analyse van familielid 14 gaf een piek NPL-score van 18,41 rond een 5,0 cM gebied tussen D13S886 en D13S309 met een overeenkomstige parametrische LOD-score van 2,44. De maximale tweepunts parametrische LOD-score verkregen met FASTLINK over de gehele familie was 2,81 met de marker D13S1490 en de parametrische multipunts LOD-score van 3,71 over de gehele familie was verkregen met LINKMAP met de markers D13S886, D13S129 en D13S132. Om ten volste gebruik te kunnen maken van alle familie- en markerinformatie werd een SIMWALK analyse gedaan voor alle 31 markers op chromosoom 13. Deze analyse bevestigde significantie van de GENEHUNTER en FASTLINK resultaten. De NPL piekt op dezelfde locatie als GENEHUNTER met bijna identieke probabiliteitwaarden (P=0,0006 resp. 0,0007). Ook was een goede overeenkomst verkregen uit de parametrische analyse met een FASTLINK-score van 3,17 en een SIMWALK-score van 2,996. Om te bevestigen dat de bevindingen voor linkage geschikt waren voor een model werden een parametrische en niet parametrische analyse uitgevoerd. De maximale tweepunts parametrische LOD-score verkregen met FASTLINK was 2,22 voor marker D13S132. GENEHUNTER analyse van de stamboom gaf een identieke NPL-score van 18,41 (P< 0,0007).
Deze resultaten gecombineerd met haplotype analyse binnen de familie bevestigen linkage van MMVP3 aan 18,61 cM regio op de lange arm van chromosoom 13. Iedereen met een volledig diagnostische mitralisklepprolaps en prodromale familieleden delen een haplotype met een 12-allelenkern voor de markers D13S265 tot en met D13S892. Vijf niet aangedane individuen (12772, 14216, 12776, 12775 en 12276) bleken niet-expressieve dragers van het haplotype, waarvan er drie jonger zijn dan 15 jaar en de andere twee 30 en 36 jaar. Dit is consistent met een model van leeftijdsafhankelijke penetrantie zoals geobserveerd in eerdere familiestudies. Van de vier gerelateerde individuen met een minimale systolische stoornis hadden er twee het complete haplotype (12270 en 12191) en een (13549) droeg het ziekte haplotype voor de proximale drie markers.
Een recombinatie bij individu 12184 tussen markers D13S794 en D13S265 definieert de proximale grens van de gelinkte regio, terwijl een recombinatie in individu 12591 tussen markers D13S892 en D13S786 de distale grens vastlegt.

Figuur 3. De situering van de genlocus op chromosom 13.

Het complete ziekte haplotype en de locaties van de proximale en distale crosses die het 8,2 Mb kandidaat interval definiëren, wordt getoond in de afbeelding. De resultaten bevestigen dat een derde MVP locus, MMVP3, ligt tussen D13S794 en D13S786 op chromosoom 13q31,3-q32,1. De huidige transcriptiekaart voor deze regio bevat 16 genen en toont gelijkaardigheid met het muizenchromosoom 14.

Discussie
Deze analyse toont aan dat er een locus voor autosomaal dominante mitralisklepprolaps (MMVP3) gelegen is op de lange arm van chromosoom 13. Deze bevinding bevestigt verder de genetische heterogeniteit van mitralisklepprolaps, aangezien deze eerder al gelinkt werd aan chromosomen 11 en 16 en het geslachtschromosoom X. In tegenstelling tot eerdere negatieve studies toont de identificatie van loci op de chromosomen de kracht van de huidige aanpak gecombineerd met de huidige diagnostische criteria met systematische genoomscanning. Genetische heterogeniteit biedt mogelijkheden om de relaties tussen genetische defecten en verschillen in expressie van ziekte en anamnese te onderzoeken, evenals het bieden van aanwijzingen in de zoektocht naar genen. De genetische analyse heeft belangrijke klinische inzichten opgeleverd en een spectrum van expressies onthuld die vroeger als een normale variant werden beschouwd,maar nu worden gezien als hebbende dezelfde genetische basis in de familiale context. Hoewel dikke klepbladen en mitralisklepregurgitatie geassocieerd zijn bij de individuele patiënt, treedt een spectrum van klepabnormaliteiten op binnen een familie, die kunnen variëren in de ziekte expressie, het stadium van progressie en in modificerende factoren. Dit spectrum omvat ook familieleden met minimale stoornissen die juist door studies als deze gevonden kunnen worden. Het kan duiden op milde of vroege genexpressie die dus opgevolgd dient te worden. Het herkennen van vormen is belangrijk omdat de ziekte zich vaak klinisch manifesteert rond de 40 tot 60 jaar als ernstige cardiale aandoening. Vroege interventie om klepblad spanning te verminderen bij genetisch verdachte individuen, zoals bij een Marfan voor aortadilatatie, kan potentieel preventief zijn voor progressie naar complicaties en hartfalen.
De herkende prodromale morfologie, die bij eerdere studies nog niet eerder werd gemeld, werd ook verkregen in de familie gelinkt aan de MMVP2 locus op chromosoom 11. Bij het bekijken van alle echocardiogrammen vond men in deze studie vijf individuen met een prodromale morfologie, die dragers van het haplotype bleken, evenals nog een ander individu met een minimale systolische verplaatsing. In de familiale context had hierdoor de prodromale bevinding diagnostische waarde en kracht. Dit is aannemelijk omdat deze morfologie, een naar anterieur verschoven coaptatie, kan worden geassocieerd met een toegenomen lengte van het posterieure klepblad. Deze associatie werd herkend bij chirurgische reparatie van patiënten met lange posterieure klepbladen,die voorbeschikt zijn tot anterieure coaptatie verschuiving en obstructie van de linker ventriculaire outflow tractus. Kwantitatief werd gevonden dat de hoogte van coaptatie in relatie tot de annulus of linker ventriculaire diameter gecorreleerd is met de ratio van anterieure en posterieure klepbladlengte (r= 0,83 tot 0,85) in de chromosoom 11 familie. Door deze bevindingen kan een minimale stoornis niet langer beschouwd worden als een normale variant in de familiale context. Posterieure klepbladasymmetrie blijkt en belangrijke rol te hebben in het mechanisme van mitralisklepregurgitatie en de definitie van mitralisklepprolaps. Genetische studies zijn daarom belangrijk om inzicht te geven in de beste klinische aanpak voor individuen met zulke eerder niet gediagnosticeerde kenmerken. De associatie tussen vormen die niet aan de diagnostische criteria voldoen en de MVP-loci kan niet geëxtrapoleerd worden vanuit de context van familiale mitralisklepprolaps. Zoals bij hypertrofische cardiomyopathie waarbij het onderscheid tussen de normale variatie en pathologische hypertrofie gemaakt moet worden bij genetische studies laat de familiale context het gebruik toe van meer gevoelige criteria zonder opoffering van de specificiteit. Follow-up studies zijn nodig om te bepalen in hoeverre deze niet diagnostische vormen zich ontwikkelen en van welke factoren dit afhangt.

De huidige transcriptiekaart voor de 8,2 Mb MMVP3 kandidaatregio op chromosoom 13q31,3-32,1 bevat 16 genen, die overeen blijken te komen met muizenchromosoom 14. Een intimadikte gerelateerde receptor (ITR) werd geïsoleerd uit een hart cDNA bibliotheek. Het bevat een N-terminale signaalsequentie, zeven transmembranaire domeinen en een kentekenmotief gevonden in een lid van de rhodopsineachtige G-proteïne-gekoppelde receptor superfamilie. ITR-null muizen suggereren dat dit gen belangrijk is in de regulatie van vasculaire remodeling. Glypicaan 5 en 6 (GPC5 en 6) zijn leden van de familie van de celoppervlakte heparansulfaat proteoglycanen die een belangrijke rol spelen in de celgroei, controle en differentiatie. GPC6 is gevonden in de mesenchymale weefsels van muizenembryo's. Het is geweten dat myxomateuze kleppen significant meer glycosaminoglycanen bevatten dan controle kleppen. Dit suggereert dat deze genen een hoge prioriteit voor screening hebben.
Zoals eerder gemeld is men er nog niet achter om welk gen binnen deze locus het gaat.